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層析實驗冷柜廠家淺談層析的四種方法

 更新時間:2015-09-02    點擊量:3102

一、凝膠過濾層析

    凝膠過濾分子篩層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相,對混合物中各組分按分子大小進行分離的層析技術(shù)。具有分子篩作用的物質(zhì)很多,如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。

    凝膠過濾層析的應用

1、可分離相對分子量從幾百到幾十萬的物質(zhì)具有3000個理論塔板的凝膠過濾可將分子量相差2倍的蛋白質(zhì)*分開,6000個理論塔板的可將分子量相差1.5倍的蛋白質(zhì)*分開;建議柱高在80-120cm,直徑=H/30

2.脫鹽

   凝膠過濾層析的特點:

1、層析柱規(guī)模很大,實驗室1.0-2.5×30-100cm,工藝10-20×200cm,從而設備成本很高;

2、上樣體積少,必須少于柱床體積的3%才能達到較好的分離效果,如果大體積樣品必須濃縮,從而造成樣品的損失和增大工藝的復雜性;

3、工藝時間(生產(chǎn)周期)長,甚至24小時或以上;

4、分辨率低;

5、不需摸索純化條件,按照分子量區(qū)帶分離。因此,往往用分子篩分離時只適用于純化的后一步,或離子交換上樣前的脫鹽。

二、離子交換層析

    離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相,利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的一種方法。

1、緩沖液與pH:選擇適當?shù)木彌_體系,起始濃度要盡可能低些(0.01-0.05M)緩沖液PH值:陽離子低于pI一個pH單位以上陰離子通常高于pI一個pH單位以上。蛋白質(zhì)在不同pH下保留行為差別較大,所以許對緩沖體系和操作pH進行摸索,以得到佳層析條件。

2、離子強度;洗脫時多采用離子濃度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.在不同鹽濃度(離子強度)及其不同變化率(梯度)條件下保留行為不同,需對該條件進行摸索。一般的,隨離子強度增加,蛋白質(zhì)保留值減小。

三、疏水層析

原理:基于生物分子表面疏水性不同而達到分離的技術(shù)。疏水作用來自于分子的水化結(jié)構(gòu),高濃度鹽溶液破壞生物分子的水化結(jié)構(gòu),使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團暴露于分子外表面,從而可與疏水介質(zhì)結(jié)合。不同離子的疏水性–Anions:SO42->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN–Cations:Mg2+>Li+>Na+>K+>NH4+。

    蛋白質(zhì)以高濃度鹽溶液結(jié)合與疏水層析柱上,以低濃度鹽溶液洗脫。生物分子表面大都有或強或弱的疏水區(qū)域,在不同環(huán)境下,與各種疏水介質(zhì)產(chǎn)生不同強弱的結(jié)合。高離子強度可加強疏水性。跟離子交換相反,高鹽吸附,低鹽洗脫;洗脫樣品又可直接或稍加稀釋后加上其他層析柱,作為連接層析步驟的橋梁,取代鹽析沉淀技術(shù)。配體種類繁多,很難預測哪一種、哪一個條件適合,可用疏水層析試盒選擇介質(zhì)

四、親和層析

    親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力,從而達到分離目的的一類特殊層析技術(shù)。親和層析純化過程簡單、迅速,且分離效率高。

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